遺伝子とタンパク質の研究 オープンアクセス

抽象的な

MyoDに対する抗体はミオジェニン有機現象とアグリン誘発神経伝達物質受容体凝集を減少させる

 Erica E Anderson1、David H Campbell2、Kelly Ezell1、Paul R Standley2、Wade A Grow1

筋形成抑制因子ファミリー、および MyoD とミオジェニンは​​、筋形成と収縮結合の形成を誘導します。ミオジェニンの生理的変化は MyoD によって活性化され、ミオジェニンの機能の 1 つは、収縮結合における神経伝達物質受容体 (AChR) の生理的変化を活性化することです。運動ニューロンは、成長中に筋線維に近づくとアグリンを放出し、これが既存の AChR の集合を収縮結合形成の位置に導きます。私たちは、MyoD またはミオジェニンに対するタンパク質への継続的な曝露が、C2C12 筋細胞培養におけるアグリン誘導性 AChR 集合を減少させることを以前に否定できませんでした。私たちの目的は、MyoD とミオジェニンが成長中にどのように作用するかをより具体的に明らかにすることでした。方法: C2C12 細胞培養を、実験的操作、および MyoD とミオジェニンに対する抗体、およびミオジェニン モルフォリノに曝露しました。エンドポーターは、実験的操作の細胞取り込みを増加させるために使用されます。 AChR 凝集アッセイを実施し、タンパク質またはモルフォリノがアグリン誘発性 AChR 凝集に与える影響を評価しました。ウェスタン ブロットは、タンパク質またはモルフォリノへの曝露時のミオジェニンの生物学的現象にアクセスします。結果: ここで示した結果は、ミオジェニンへのタンパク質の 8 時間という短い曝露が、ミオチューブにおけるアグリン誘発性 AChR 凝集を減少させることを示しています。いくつかの実験操作がミオジェニンの生物学的現象を縮小し、同時にアグリン誘発性 AChR 凝集の減少をもたらすことは、これまで疑いの余地がありません。この結果は、MyoD へのタンパク質の曝露がミオジェニンの生物学的現象を縮小し、同時にアグリン誘発性 AChR 凝集の減少をもたらすことを実証することにより、ミオジェニンがコントラクター ジャンクション形成にどのように作用するかを具体的に示しています。結論: これらの結果は、ミオジェニン酵素の活性化、AChR酵素の活性化、そして最終的にはアグリン誘導性AChR凝集およびコントラクタージャンクション形成に適切なレベルのAChRの生成というメカニズムを通じて、MyoDがアグリン誘導性AChR凝集に重要であることを示唆している。AChRは、テトラメチルローダミンに結合したα-ブンガロトキシン（Molecular Probes）の結合によって標識された。培養物は毒素含有培地中で30分間30分間培養され、DM中で72時間培養した後、AChRを標識した。カバースリップは、高温リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で3回すすぎ、PBS中のパラホルムアルデヒド2倍液で10分間マウントし、PBSで3回すすぎ、-20°Cで5分間冷アルコールで脱水し、可視光用Vectashieldマウント培地（Vector Laboratories）で拡大鏡スライドにマウントした。 AChR クラスターは、20 倍の対物レンズの下の Olimbos IX70 倒立拡大鏡を使用して視覚化され (完全な拡大率は 200 倍)、蛍光画像は Magnafire デジタル イメージング パッケージを備えた Olimbos カメラを使用して高解像度の JPG ファイルとしてキャプチャされました。蛍光画像では、筋管のあらゆる側面に明るい AChR のクラスターが見つかりました。各グレースケール画像は、Cell Profiler のオブジェクト識別式を使用して分析されました。式で使用されているしきい値は、クラスターの一部としてカウントされるためにピクセルが示す必要のある最小の蛍光強度として定義されました。しきい値の実験により、最小輝度が 70 パーセントの場合、クラスターの一部としてカウントされるのに十分な可視光を持つピクセルが定義されることが明らかになり、このしきい値がすべての分析に使用されました。適切な判断と一貫した定量化を保証するために、しきい値とすべての代替設定は、すべてのグループと画像で一貫して一定でした。筋形成中の配列活性化のモデルは、MyoD によるミオジェニンの活性化に続いて遺伝子がオンになることを予測しています。筋原性分化の最初のブループリントは、ゲノム全体の転写因子結合と発現識別を組み合わせて、クラス筋細胞における筋原性分化プログラムをよりよく解明しました。筋原性制限因子は、筋形成とコントラクター ジャンクションの構築を制御します。具体的には、成長中の筋芽細胞において、MyoD が結合の指定と構築に関与する遺伝子を標的にしていることは、最初の設計図で議論の余地なく示されました。
キーワード: AChR、アグリン、C2C12、配列発現、MyoD、ミオジェニン、コントラクタージャンクション。