アメリカの薬物送達と治療学ジャーナル オープンアクセス

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糖尿病治療用クラスII薬グリピジドのβシクロデキストリン複合経口マトリックス錠のin vitro評価

ラジェシュ

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ヘリコバクター ピロリ菌はグラム陰性細菌で、マーシャルとウォーレンによって胃炎や消化性潰瘍の患者の胃粘膜から初めて分離されました。ヘリコバクター ピロリ菌は胃粘膜の慢性感染症の主な原因であり、世界人口の 50% が罹患しています。最近、H. ピロリ菌は胃潰瘍、十二指腸炎、胃炎などの他の合併症を引き起こすことが示されています。文献によると、H. ピロリ菌に感染した患者のかなりの割合は胃十二指腸疾患を発症せず、長期間無症状のままである可​​能性があります。一方、長期感染は腺癌や胃リンパ腫などの疾患のリスクを高めます。

いくつかの研究により、H. pylori は究極の発癌物質であることが確認されています。Helicobacter pylori 感染に関連する死亡率は、感染男性 34 人に 1 人、感染女性 60 人に 1 人であると推定されています。Helicobacter pylori は、H. pylori の生存と発病に必要な大量のウレアーゼ (全タンパク質重量の 10% - 15%) を生成します。多くの酵素が、尿素からアンモニアと炭酸塩を生成することで、H. pylori の周囲の酸性度を低下させます。Helicobacter pylori ウレアーゼは、分子量 550 kDa の多量体酵素で、UreA (29.5 kDa) と UreB (66 kDa) の 2 つのサブユニットから構成されています。最近、研究者は H. pylori 感染に対するワクチンの開発に関心を持っています。さまざまな候補抗原の中で、尿素とは異なり、精製された尿素Bでマウスを免疫すると免疫原性と防御力が高くなるため、尿素Bが最も効果的であると考えられています。免疫ターゲットとして尿素分解酵素を選択した理由は、膜タンパク質が免疫応答を誘発することが多いという事実に基づいています。この研究では、エピトープマッピングに高性能な予測ソフトウェアプログラムを使用しました。Bリンパ球のいくつかの特定のエピトープが隣接しているため、このプログラムは尿素B遺伝子のアミノ酸フラグメントを選択しました。さらに、抗原フラグメントは大腸菌BL21（DE3）株の組み換えタンパク質として発現および精製されました。この研究の目的は、関連ソフトウェアプログラムを使用して、重要な抗原特性を持つ組み換え尿素B（rUreB）のフラグメントを提示することです。

2. 目的

本研究の目的は、H. pylori 由来の UreB の抗原領域から構成される組み換えベクターを、抗原の全配列と大腸菌での発現の代わりに免疫優勢エピトープを使用して提供することであった。また、ワクチン候補としての抗原性を決定し、ヒトにおける H. pylori 感染の血清学的診断における有効性を評価することを目指した。

3. 方法

3.1. 細菌、プラスミド、その他の試薬の調製

この研究では、通常の診断内視鏡検査を受けている消化不良患者の生検から H. pylori を培養しました。生検に先立ち、研究への参加についてすべての患者からインフォームドコンセントを得ました。培養条件は、以前の報告の所見に基づいて決定しました。単離された生検標本は、トリメトプリム (5 µg/mL)、バンコマイシン (10 µg/mL)、およびアムホテリシン B (2.5 µg/mL) を含み、5% の羊血液を添加したブルセラ寒天培地 (Merck、ドイツ) で培養しました。

37°C（CO2：10％）で3〜5日間微好気条件下で培養した後、グラム染色、オキシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ試験などの通常の微生物学的試験により、増殖した細菌はH. pyloriと同定されました。さらなる評価のために、pET-32aおよびpBSKベクター（Novagen Inc.、米国）を使用しました。さらに、pET-32aベクターを使用して、6ヒスチジンタグとN末端T7エピトープタグとの融合タンパク質を生成しました。これらの追加アミノ酸により、生成されたタンパク質の重量が最大20 kDa増加しました。本研究では、制限酵素とDNAリガーゼをFermentas（リトアニア）から購入し、最初のクローニングにはE. coli DH5α株（Stratagene、米国）を使用しました。さらに、組み換え pET-32a (pET-32a UreB) を細菌の宿主株である E. coli BL21(DE3)pLysS (Novagen、米国) に形質転換しました。通常の細菌培養には、Lysogeny ブロス (Luria-Bertani ブロス、LB、Sigma、米国) を使用しました。アンピシリン (100 µg/mL) およびクロラムフェニコール (34 µg/mL、Sigma、米国) などの必要な抗生物質を LB 培地に添加しました。

結果: PCR の配列結果は、UreB 遺伝子が組み換えプラスミドにクローニングされたことを示しました。タンパク質の生成はイソプロピル β-D チオガラクトピラノシド (IPTG) によって誘導され、発現したタンパク質は Ni-NTA キットを使用して透析により精製されました。さらに、分子量 42 kDa の組み換えタンパク質は、ウエスタンブロッティングで抗体によって認識されました。

結論:抗体の評価により、免疫学的バイオインフォマティクスによって予測された免疫原性フラグメントの高い抗原特性が示されました。したがって、UreB 組み換えタンパク質は、H. pylori に対するワクチンやその他の診断キットの開発に適した抗原である可能性があります。